转化医学研究中心德国徕卡显微镜部培训总结—境外学习交流

        我于8月1号-8月5号参加了徕卡显微镜公司的用户培训。培训内容主要集中在激光共聚焦显微镜的原理与应用，激光共聚焦显微镜配套软件的使用进阶和拓展，超高分辨激光共聚焦显微镜的特点与适用范围，光片扫描与高速三维扫描的原理和应用。下面将主要介绍两种最常用的技术：

       （一）激光共聚焦的原理和应用

       激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。

       基于此特点，激光共聚焦显微镜可用于细胞形态学分析（例如观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；通过软件计算得到的半定量免疫荧光分析）；可用于荧光原位杂交研究，例如靶标蛋白或分子在细胞内的亚定位，在细胞膜、线粒体膜、细胞核膜上的分布与转运；也可用于细胞与靶标分子的三维重建分析，利用叠层扫描技术，可选择一定厚度的扫描距离，完成指定步进的扫描方式，最后通过软件合成叠加，形成三维图形。

       在不同研究领域，可有的应用具体如下：（1）在细胞及分子生物学中的应用：细胞、组织的三维观察和定量测量；活细胞生理信号的动态监测；粘附细胞的分选；细胞激光显微外科和光陷阱功能；光漂白后的荧光恢复；在细胞凋亡研究中的应用。（2）在神经科学中的应用：定量荧光测定；细胞内离子的测定；神经细胞的形态观察。（3）在耳鼻喉科学中的应用：在内耳毛细胞亚细胞结构研究上的应用；激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术在内耳毛细胞研究中的应用；激光扫描共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究上的应用；激光扫描共聚焦显微镜在嗅觉研究中的应用。（4）在肿瘤研究中的应用：定量免疫荧光测定；细胞内离子分析；图像分析：肿瘤细胞的二维图像分析；三维重建。（5）在内分泌领域的应用：细胞内钙离子的测定；免疫荧光定位及免疫细胞化学研究；细胞形态学研究。（6）在血液病研究中的应用：在血细胞形态及功能研究方面的应用；在细胞凋亡研究中的应用。（7）在眼科研究中的应用：利用激光扫描共聚焦显微镜观察组织、细胞结构；集合特殊的荧光染色在活体上观察角膜外伤修复中细胞移行及成纤维细胞的出现；利用激光扫描共聚焦显微镜观察视网膜中视神经细胞的分布以及神经原的树枝状形态；三维重建。

       （二）超高分辨率激光共聚焦显微镜

       超高分辨率激光共聚焦显微镜主要由激光照射系统，扫描检测系统，显微镜系统，计算机系统及相关软件等组成。超高分辨率激光共聚焦显微镜可被广泛应用于细胞生物学、生物化学、药理学、生理学、发育生物学、遗传学、组胚学、神经生物学、微生物学、寄生虫学、病理学、免疫学、环境医学和营养学等各个领域。

       STED显微镜目前唯一一种纯光学实现超高分辨率的显微技术，不依赖于数学计算，所见即所得。当然结果可以通过进一步的去卷积处理得到改善。甚至于在实时扫描中，您也可以仅仅点一下鼠标，就可以立刻从普通共聚焦转到超高分辨率。几秒钟之内，图像就会得到优化，并获得超解析度图像。STED显微镜适用标准荧光染料，如 Alexa 488, Oregon Green 488 和 FITC。它不依靠包埋介质中的氧消耗或还原剂。Citrin，eYFP和eGFP也会有令人信服的结果。这让您可以尽可能地使用常规实验方案，节约时间和费用。双色STED成像可以在纳米级水平进行共定位研究。由于所有颜色均使用同样的STED环形，因此就无需对色差进行补偿校正。STED显微镜将样品漂移影响减小到了最小的程度，并结合了本身的光切能力以及快速图像的采集。合适的荧光蛋白进一步使STED图像具有揭示活细胞内甚至原核微生物快速的动态过程。

       徕卡TCS STED CW可快速获取双色超高分辨率图像。选择激发谱不同而发射谱接近的荧光染料，只用一个损耗激光即可实现双色成像。这样的好处在于：降低使用的复杂性，排除任何因为色差导致的潜在误差，而且无需任何数学校正。该系统极具稳定性，能防止样品漂移，确保数据准确，并易于处理。双色STED超高分辨率成像使得蛋白共定位研究进入一个更高的水平。

       STED特别适合应用于组织和细胞内微小结构和物质的观察，如膜蛋白与膜微结构域、膜结构细胞器内部的微小结构观察、细胞骨架结构、神经元突触研究、细菌内部的物质结构研究等等。实验证明，STED超高分辨率显微技术能很好地胜任介于光镜与电镜分辨率之间的结构和物质的观察，正在不断改变我们对细胞内部结构及运作的认识。目前，已有很多科学家使用STED超高分辨率显微镜获得了大量突破性的研究成果，发表了大量高质量的文章。

       （三）关于徕卡显微镜

       徕卡拥有160年显微镜生产历史，以高质量光学系统而闻名。徕卡一贯注重产品研发和最新技术应用，其产品质量一直走在显微镜技术前列。徕卡特别注重几何特性的同时特别关注的光的波动相位特征，将光程差控制在光谱波长的几分之一误差范围内，达到纳米级的误差，而几何光学的误差范围在百纳米级的精度。这着重体现在徕卡独家的STED用相干光做成几十纳米级甜麦圈形状获得其它厂家无法实现的活细胞50nm的最高分辨率。U型光路设计又是徕卡注重光学保真度的另一体现。图像误差表现在不同的方面，譬如色散，畸变，彗尾现象等方面，一些厂家考虑主要的色差和反差方面，殊不知色差，反差，对比度并不是原因而是现象，物理原理客观存在，不是用蛮力可以解决的。徕卡从系统整体性入手，利用对称误差设计来创造性的抵消各部件的误差，让图像更真实更精确。并在业内制造出负光学特性的第一块人工萤石玻璃。萤石物镜的高透过率就是得益于徕卡的贡献。

       自从1873年德国物理学家恩斯特-阿贝（Ernst Abbe）第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有关。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm。一直以来，200nm的“阿贝极限”一直被认为是光学显微镜理论上的分辨率极限，小于这个尺寸的物体必须借助电子显微镜或隧道扫描显微镜才能观察。直到一个多世纪之后，罗马尼亚物理学家Stefan Hell应用STED（stimulated emission depletion，受激发射损耗）技术推翻了这一观点。他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。Stefan Hell凭借STED的发明，获得了2006年度的德国“未来奖”这一科学荣誉。2008年，《Nature》杂志将包括STED在内的超高分辨率显微技术评为年度技术。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求，借助显微镜从纳米水平上对细胞内的结构及活动过程进行真实的观察能让人们发现许多以往所不了解的东西。

       （四）最后附上几张图片供大家参考